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　　在白血病的免疫治疗中，CAR-T细胞疗法以其显著的疗效备受关注。然而，长期缓解难以维持，约半数患者在治疗后1年内复发。CAR-T细胞功能的持久性与临床长期疾病缓解密切相关。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进展揭示了影响CAR-T细胞持久性疗效的分子机制，然而目前大多数单细胞CAR-T数据来源于临床随访不足2年的患者，对于那些能够实现超过5年持久缓解的CAR-T细胞特征尚不清楚。2024年9月25日，耶鲁大学的研究团队在《Nature》杂志发表了题为“Single-cell CAR-T atlas reveals type2 function in 8-year leukaemia remission”的研究论文，揭示了CAR-T细胞的2型免疫在维持长期缓解中起着关键作用。

　　研究团队对82名患有复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的儿童患者及6名健康捐赠者的基线状态和抗原刺激后（CD19-3T3共培养12小时）的CAR-T产品进行了单细胞多组学分析，获得了近70万个CAR-T细胞转录组和表面蛋白表位测序数据。通过无监督聚类和UMAP可视化，数据集划分为17个不同亚群，主要按刺激条件(CD19-3T3共刺激12小时)进行分离，展示了特定T细胞亚型的表面标记，并且观察到最小的批次效应。通过分析细胞周期得分，研究推断出每个细胞的周期阶段（G1、G2/M或S），并根据记忆和细胞周期状态将基础状态的CAR-T细胞划分为8个子簇。簇11的一小部分CD8+细胞表现出高细胞毒性标志，表明在CAR-T细胞的制备过程中细胞出现低水平的自发激活。抗原刺激后，绝大多数细胞呈现出1型细胞特征，而簇7则包括2型、9型和17型CD4+细胞，伴随着CCL3和CCL4表达的上调。通过伪批量热图，进一步确认了基础状态的CAR-T细胞的转录和蛋白质表达特征，揭示了其多样的功能状态 (图1)。

　　为了探索CAR-T细胞产品异质性与临床疗效持久性的关联，研究团队根据患者B细胞再生障碍(BCA)持续时间分为五组，分别为BCA-1 (持续时间不到3个月包括未缓解组中的所有患者)、BCA-2/BCA-3 (大部分患者经历了抗原阳性/阴性复发)、BCA-O (中位BCA持续时间为5.1年)和BCA-L (n=5，中位BCA持续时间为8.4年)。分析发现BCA-L组基线状态的CAR-T细胞具有保守的记忆状态、低增殖活性以及较弱的细胞毒性和共抑制特征，表明其保持非活跃状态的能力可能与CAR-T细胞的长期持续性相关 (图2)。

　　为了解其早期免疫激活动力学，研究团队进一步评估了抗原刺激后的CAR-T细胞。UMAP聚类分析显示，BCA-L组细胞在特定簇（如簇0和簇7）中比例显著增加，这些簇以记忆评分和2型评分富集表达为特征，反映了增强的记忆状态和适应性免疫特性。在不同的患者组间，BCA-L和BCA-O组显示出一致的分子特征，包括更高比例的2型细胞和较高的记忆评分。对长期缓解患者的进一步分析显示，2型免疫特征在持久应答患者CAR-T细胞中显著增加，提示2型功能在CAR-T细胞的长期持久性中可能起到关键作用。流式细胞术进一步分析证实，BCA-L组中表达IL-3、IL-4、IL-5、IL-13和IL-31的CAR-T细胞比例显著高于BCA1和BCA2组。此外，细胞因子分泌组学分析表明，BCA-L和BCA-O组患者的CAR-T细胞在分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IL-21方面具有较高指数。ATAC和转录组分析揭示，BCA-L组在GATA3和其他2型细胞因子基因区域中的染色质可及性显著增加，而1型调节因子（如IFNG、STAT1和TBX21）可及性差异不明显（图3）。GATA3的基序活性在BCA-L组细胞中显著富集，而STAT6并未表现出显著差异。进一步实验表明，GATA3在维持2型功能和长期CAR-T细胞持久性中的作用优于STAT6。这些结果表明，GATA3上调驱动的2型功能增强可能是BCA-L和BCA-O组患者中CAR-T细胞持久治疗效果的关键因素。

　　为了研究2型功能细胞在维持CAR-T细胞寿命中的调节作用，研究者利用scRNA-seq数据分析了配体-受体表达模式，评估细胞间的免疫通讯。结果表明，在簇7中的2型细胞与簇2的CAR-T细胞间存在显著的L-R通讯，其中簇2细胞表达较高的受体（如Il2RG、CD53和CSF2RB），这些因子涉及T细胞存活、增殖及免疫功能。这表明2型细胞因子能够广泛调节CAR-T细胞群体，特别是通过簇2中的细胞，维持其存活和功能。簇2的细胞展示了显著的细胞毒性及高表达共抑制标志物，但也表现出增殖能力和细胞因子产生能力减弱，呈现出一种功能失调的晚期分化状态。值得注意的是在BCA-L组中，簇2细胞比例显著低于短期BCA组，且共抑制评分较低，表明2型功能的增强有助于缓解功能障碍CAR-T细胞（图4）。

　　进一步研究表明补充10ng/ml IL-4对CAR-T细胞激活和功能具有促进作用。体外研究显示，添加IL-4显著增加了CAR-T细胞的增殖，并降低功能失调细胞比例。此外，IL-4的补充改善了代谢活性、免疫功能和细胞增殖，减少细胞凋亡。染色质可及性分析显示，显著上调了1型和2型标记物以及关键调节因子CSF2的活性。总而言之，IL-4通过增强2型功能对功能失调的CAR-T细胞进行有效调节，维持了CAR-T细胞群的平衡功能和适应性。

　　为了评估CAR-T细胞输注后患者的免疫反应，研究团队对两个患者队列的血清蛋白进行了全面分析。发现队列中包括33名患者（其中4名属于BCA-L组），验证队列中包括8名患者（其中3名属于BCA-O组）（图5）。结果表明，长期BCA-L和BCA-O患者2型细胞因子（特别是IL-13）的水平显著高于其他组患者，而1型细胞因子及某些趋化因子在不同患者组之间没有显著差异。基线数据表明，BCA-L组患者在输注前2型细胞因子水平显著增高，形成了有助于CAR-T细胞平衡反应的环境。在输注后的CAR-T快速扩增期（第6-8天）到2个月内，BCA-L组患者的2型细胞因子血清水平持续升高，而1型细胞因子无显著变化。验证队列的分析得到了类似的结果，进一步支持了2型细胞因子在BCA-L和BCA-O患者中的关键作用。通过UMAP聚类分析，研究发现BCA-L患者的血清蛋白特征聚集在一个富含IL-13和IL-4的簇中，证实了2型细胞因子在维持CAR-T细胞持久疗效中的重要性。

　　鉴于在持久性 CAR T 细胞中观察到更高的2 型免疫评分，我们接下来检查了 2 型免疫高表达（2型high）CAR-T 细胞是否可以在体内引起增强的抗肿瘤功效。研究者通过聚类分析选择了2型high的ND463样本和2 型免疫低表达（2型low）的ND585样本，并在NSG小鼠白血病模型中研究它们的功能。结果显示，两种CAR-T细胞产品在早期均能清除肿瘤细胞，但2型highCAR-T细胞在体内扩增能力显著增强，在第8天和第12天的CAR+细胞计数分别比2型low组高出至少10倍 (图6)。此外，在第17天再次引入肿瘤后，2型highCAR-T细胞表现出增强的记忆反应，显著延长了小鼠的生存时间。功能分析显示，2型highCAR-T细胞的抑制标记物（PD-1、TIM3、LAG-3和KLRG1）表达较低，且凋亡标志FAS表达减少，表明其具有较低的耗竭倾向。同时，2型highCAR-T细胞中的IFN-γ表达显著增加，表明2型highCAR-T细胞不会抑制1型反应。进一步研究表明，这些细胞在初期清除肿瘤后保持良好的记忆表型，中央记忆标记CD27和CD45RO的表达在第12天显著增加。为了进一步验证2型细胞的作用，研究者通过筛选去除2型highCAR-T细胞中的2型亚群，结果显著降低了抗肿瘤能力，抑制性特征增加，1型功能性降低，记忆状态减少。补充IL-4可部分恢复该群体的活力，且进一步提升了CAR-T细胞的数量。这些数据支持了2型功能的增强能够减少CAR-T细胞的耗竭并保留中央记忆状态，从而在肿瘤复发时表现出卓越且持久的治疗效果。

　　下一步研究者探讨了增强2型功能是否能提升2型lowCAR-T样本（ND585）的抗肿瘤性能，并测试了两种策略：(1)在输注前使用10ng/ml IL-4预处理CAR-T产品(primed CAR-T cells)；(2)从采集T细胞开始，将2型细胞因子掺入CAR-T细胞的制备过程中，生成增强型2型CAR-T细胞（ET2-L，IL-4 10 ng/ml;ET2-H，IL-4 50 ng/ml）。研究显示增强型2型CAR-T细胞表现出显著的抗复发能力，即使在第二次接种肿瘤细胞时仍具有很强的抗肿瘤能力，并且优于IL-4预处理的CAR-T产品。此外，增强型的CAR-T细胞在外周血中的扩增显著增加，且抑制标志物表达减少，IFN-γ水平提高，生存期显著延长（图7）。

　　在进一步研究中，研究者在BCA2组患者(DC80)的CAR-T细胞中用IL-4预处理，发现IL-4引发的CAR-T细胞在体外重复刺激实验中表现出显著的肿瘤杀伤能力和更强的记忆特征，即使在较低的效应/靶标（E:T）比例下仍保留50%活性。这些结果表明，增强2型功能的策略，尤其是在制备过程中添加2型细胞因子，有助于改善2型功能低的CAR-T细胞功能，并提高长期抗肿瘤能力。

　　该项研究深刻揭示了2型功能在CAR-T细胞持久性中的重要性，并为实现肿瘤的长期缓解提供了新的思路。同时，《Nature》同期发表了另一篇背靠背研究文章，该团队与合作者揭示了IL-4通过STAT6和PI3K-Akt-mTOR通路促进LDHA依赖的糖酵解以提升CD8+ T细胞的功能机制。通过增强2型CAR-T功能，科学家们正在迈向让肿瘤复发成为历史的目标。这一发现不仅具有深远的科学意义，还将为未来免疫治疗的优化带来巨大的潜力。

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